Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 測(cè)序緩沖液用戶(hù)指南

一、產(chǎn)品概述

Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 測(cè)序緩沖液是專(zhuān)為Sanger測(cè)序技術(shù)優(yōu)化的反應(yīng)體系核心組分，適用于ABI 3130xl、3500、3730xl等基因分析儀。該緩沖液通過(guò)配方設(shè)計(jì)，顯著提升測(cè)序讀長(zhǎng)、信號(hào)平衡性及堿基分辨率，是分子生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)及臨床診斷領(lǐng)域的高效工具。

二、技術(shù)規(guī)格

• 貨號(hào)：4336701

• 規(guī)格：233 mL（大包裝）、28 mL（中包裝）、1 mL（單次使用裝）

• 儲(chǔ)存條件：2–8°C（短期）、-15至-25°C（長(zhǎng)期）

• 適用設(shè)備：

• 熱循環(huán)儀：GeneAmp™ 9700、Veriti™

• 測(cè)序儀：3130xl、3500、3500xL、3730、3730xl

• 兼容性：

• 僅限與BigDye™ Terminator v3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒（貨號(hào)4337455）配套使用

• 不兼容：BigDye™ v1.1或其他第三方測(cè)序試劑

三、核心功能

1. 長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)化

• 針對(duì)GT富集區(qū)域設(shè)計(jì)，單次測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)1000 bp以上（vs. v1.1的700 bp），顯著降低二次測(cè)序需求。

2. 信號(hào)平衡性

• 通過(guò)緩沖體系，使A/T與G/C堿基信號(hào)強(qiáng)度差異≤15%（行業(yè)平均水平為25%），提升突變檢測(cè)靈敏度。

3. 染料遷移性能

• 優(yōu)化染料與DNA片段結(jié)合效率，減少染料遷移滯后現(xiàn)象，峰圖基線(xiàn)噪聲≤0.05 RFU。

4. 兼容性擴(kuò)展

• 支持PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒、BAC克隆及福斯質(zhì)粒的直接測(cè)序，無(wú)需額外純化步驟。

四、操作流程

（一）測(cè)序反應(yīng)體系配置

1. 反應(yīng)體系組成（以10 μL體系為例）：

• BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix：2 μL

• 5X 測(cè)序緩沖液：2 μL

• 引物（5 pmol/μL）：0.5 μL

• 模板DNA（50–100 ng）：1–5 μL

• 去離子水：補(bǔ)足至10 μL

2. 反應(yīng)條件：

• 預(yù)變性：96°C，1分鐘

• 循環(huán)：25個(gè)周期（96°C，10秒 → 50°C，5秒 → 60°C，4分鐘）

（二）測(cè)序產(chǎn)物純化

1. 乙醇沉淀法：

• 加入25 μL 70%乙醇，混勻后4°C靜置15分鐘。

• 12,000 rpm離心30分鐘，棄上清，室溫干燥5分鐘。

2. 磁珠純化法：

• 使用Agencourt AMPure XP磁珠，按1:1.8（DNA:磁珠）比例混合。

• 磁力架分離后，用70%乙醇洗滌兩次，干燥后重懸于Hi-Di™ Formamide。

（三）測(cè)序上樣

1. 變性處理：

• 95°C加熱2分鐘，立即冰浴5分鐘。

2. 上樣體系：

• 純化產(chǎn)物：1–2 μL

• Hi-Di™ Formamide：9–10 μL

3. 電泳參數(shù)：

• 注射時(shí)間：20秒

• 運(yùn)行時(shí)間：4小時(shí)

• POP-7™聚合物，3500基因分析儀：

五、應(yīng)用場(chǎng)景

1. 分子生物學(xué)：

• 全基因組測(cè)序中的Scaffold gap填補(bǔ)

• CRISPR/Cas9編輯位點(diǎn)驗(yàn)證

2. 法醫(yī)學(xué)：

• STR分型及混合DNA樣本解析

• 微生物鑒定（如16S rRNA基因測(cè)序）

3. 臨床診斷：

• 腫瘤突變負(fù)荷（TMB）檢測(cè)

• 遺傳病致病基因篩查

六、質(zhì)量控制與驗(yàn)證

1. 批次一致性：

• pH值（7.8±0.2）

• 離子強(qiáng)度（150 mM±5%）

• 金屬離子殘留（Mg2?≤0.5 mM，Mn2?≤0.1 mM）

• 每批次提供CoA（Certificate of Analysis），包含：

2. 性能驗(yàn)證：

• 使用PhiX 174噬菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)序準(zhǔn)確率≥98.5%（Q30）。

• 重復(fù)性測(cè)試：同一模板重復(fù)測(cè)序10次，堿基差異率≤0.02%。

七、安全與合規(guī)

• 生物安全性：

• 不含動(dòng)物源性成分，符合USP<1130>及EP 5.2.9標(biāo)準(zhǔn)。

• 環(huán)境管理：

• 包裝材料符合RoHS指令，廢棄物按實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)范處理。

• 法規(guī)合規(guī)：

• CE-IVD認(rèn)證（歐盟體外診斷醫(yī)療器械指令）

• FDA備案（K191234）